Контактный телефон лаборатории: +7 (495)
Номера аудиторий лаборатории на биофаке: .
Ведущий научный сотрудник, доктор биологических наук
Основным полем научных исследований группы является изучение функций специфических рецепторов, активируемых протеазами (ПАР) и их агонистов – протеаз системы гемостаза. Ключевая протеаза гемостаза – тромбин и активированный протеин С (АПС) вовлечены в процессы воспаления, регенерации и др., т.е. имеют множество функций вне системы гемостаза, которые реализуются через ПАР.
Рис. 1. Способы активация рецепторов, активируемых протеазами (ПАР).
Данный тип рецепторов относится к классу трансмембранных семидоменных рецепторов, связанных с G-белками. Активация ПАР происходит в результате расщепления внеклеточного N-конца рецептора протеазой и образованный новый N-конец-«привязанный лиганд», взаимодействуя со второй внеклеточной петлей рецептора, активирует его (рис. 1). Агонистами ПАР выступают сериновые протеазы, в частности, протеазы гемостаза – тромбин, активированный протеин С, фактор Ха, которые посредством этих рецепторов способны регулировать функции клеток и выступать эндогенными регуляторами таких процессов как нейродегенерация, воспаление, репарация тканей, пролиферация и др.
Инициатором многолетних исследований в данном направлении была Струкова Светлана Михайловна профессор кафедры физиологии человека и животных.
В настоящее время, продолжая эти исследования нами установлено, что активированный протеин С через ПАР1 и свой собственный рецептор ЭРПС (эндотелиальный рецептор протеина С) обладает протекторным действием на культивируемые нейроны в условиях глутаматной эксайтотоксичности. Нами впервые продемонстрирована экспрессия рецепторов ЭРПС на нейронах и астроцитах. Исследование влияния тромбина на разные типы клеток и процессы, вызванные действием патологических факторов, показало, что это эффекты реализуются через ПАР1, как и эффекты АПС, но имеют противоположную направленность. Так, например, тромбин на тучные клетки оказывал провоспалительное действие, а АПС - протекторное, антивоспалительное. Такой механизм активации ПАР получил название «смещенного агонизма» («baised agonism»). Возможность активации противоположных процессов через один тип рецептора может быть связана с типом агониста, расположением рецептора, особенностями его колокализации с другими рецепторами. Так, активация ПАР1 тромбином, носит название канонической активации и реализуется через расщеплением внеклеточного N-конца рецептора по Arg41, а активация АПС – через расщепление по Arg46, что приводит к образованию отличающихся «привязанных» лигандов и запуску разных эффектов (Рис.2).
Рис. 2. Механизм «смещенного агонизма» при каноническом расщеплении ПАР1 тромбином и агонистом TRAP по сайту Arg41 и неканоническом расщеплении АПС и TR47 по сайту Arg46 (ПАР1- рецепторы1 типа, активируемые протеазами, АПС- активированный протеин С, ЭРПС эндотелиальный рецептор протеина С, КАВ1 – кавеолин 1 типа, ПКС – протеинкиназа С , RhoA и Rac1 –ГТФазы разнонаправленного действия, DVL2- фосфопротеин, взаимодействующий с β-аррестином 2.
Какую роль играет этот механизм в процессах воспаления, нейродегенерации, репарации тканей, какие молекулы и сигнальные каскады опосредуют эффекты протеаз и ПАР в условиях разных патологий – вот те вопросы, на которые мы пытаемся найти ответы и которые позволят выявить основные мишени для фармакологической коррекции тяжелых заболеваний, таких как сахарный диабет, инсульт, сепсис, травмы мозга и др.
Для выяснения механизмов повреждения мозговой ткани при ишемии, травме, инфицировании, нейродегенеративных заболеваниях и поиска мишеней для их коррекции широко используют эксперименты in vitro. Этот подход позволяет проанализировать молекулярные механизмы, запускаемые действием, как изолированных факторов, так и их комплексов, в отдельных типах клеток мозга, оценить особенности их взаимного влияния. В нашей научной группе ведутся исследования на первичных культурах нейронов и астроцитов, выделенных из разных отделов мозга новорожденных крыс и мышей. Поскольку ишемический инсульт является сложным комплексным повреждающим фактором, целесообразно, для выяснения молекулярных механизмов активации и гибели клеток мозга при ишемии, исследовать действия отдельных её компонентов, а также сочетанного влияния факторов на отдельные типы клеток, а также оценить особенности клеточных взаимодействий при данной патологии.
Наши исследования направлены на изучение механизмов действия на нейроны и астроциты таких факторов как глутаматная эксайтотоксичность, кислородно-глюкозная депривация, провоспалительных индукторов. При этом, осуществляется анализ роли разных типов ПАР, их агонистов и сериновых протеаз гемостаза в запуске патологической активации и гибели клеток. Комплексная оценка состояния клеток осуществляется с помощью современных методов и подходов: проводится оценка, как гибели клеток биохимическими (МТТ-тест, ЛДГ-тест, WST-тест) и морфологическими методами (окрашивание клеток маркерами апоптоза, витальными красителями и т.д.), так и состояние кальциевого, хлорид-ионного, АТФ гомеостаза клеток (методами трансфекции и флуоресцентного имиджинга), уровня экспрессии разных типов белков (иммуноферментный анализ, иммуноцитохимия, конфокальная микроскопия, вестерн блот) и др.
Было продемонстрировано протекторное действие низких концентраций тромбина, а также фактора Ха, АПС и нового пептида-агониста ПАР1-функционального аналога АПС – АП9 в условиях токсического действия глутамата на нейроны. Механизмом этого защитного действия являются ПАР1-опосредованная регуляция кальциевого гомеостаза нейронов и блокирование активации транскрипционного фактора NF-kB. При этом высокие концентрации тромбина потенцируют токсическое действие глутамата (Рис. 3).
Рис. 3. ПАР(PAR)-зависимая регуляция выживания нейронов при глутаматной эксайтотоксичности.
Агонисты ПАР1 обладают комплексным влиянием на астроциты крыс при токсических воздействиях. При этом действие агонистов носит разнонаправленный характер. Действие высоких концентраций тромбина приводит к появлению характерных признаков астроглиоза, таких как повышенная экспрессия GFAP, образование стресс-фибрилл, повышение пролиферации. Низкие концентрации тромбина обладают протекторным действием на астроциты при кислородно-глюкозной депривации (КГД). КГД отменяет действие АПС и его функционального аналога, АП 9, как и низкой концентрации тромбина, на F-актин астроцитов. Тромбин в высокой концентрации потенцирует действие провоспалительных факторов, в то время как неканонический агонист ПАР1 (АП9) не влияет на индуцированные воспалением пролиферацию и активацию астроцитов (Рис. 4.).
Рис. 4. ПАР(PAR)-зависимая регуляция культивируемых астроцитов крысы (КГД-кислородно-глюкозная депривация, ЛПС-липополисахарид).
Провоспалительная активация более выражена у тучных клеток (ТК), т.к. они являются специализированными иммунокомпетентными клетками. Вероятно, ключевое значение имеет блокада ТК, которые в случае своей активации повышают гибель и провоспалительную активацию клеток мозга: астроцитов и нейронов. Модуляция активности тучных клеток, астроцитов и нейронов с помощью пептида-агониста ПАР-1 – АП9, АПС и низких концентраций тромбина может стать новым инструментом снижения гибели нейронов и облегчения нейродегенеративных последствий в условии нейровоспаления (Рис.5).
Рис. 5. Модуляция активности тучных клеток, астроцитов и нейронов с помощью агонистов ПАР1:– АП9, АПС и тромбина.
Ишемический инсульт, являющийся одной из основных причин смертности взрослого населения, представляет собой комплексный патологический процесс. Поэтому исследование его механизмов не возможно без анализа механизмов ишемического повреждения на уровне целостного организма, а не только на уровне отдельных клеток.
В настоящее время предложено множество моделей ишемического инсульта головного мозга, основанных на различных способах ограничения кровотока в нем. Одной из них является фототромбоз сосудов коры больших полушарий, инициируемый световой активацией молекул фотосенсибилизатора (например, бенгальского розового – БР) (Рис. 6). При этом фотоиндуцированная фокальная ишемия считается одной из наименее инвазивных моделей ишемии in vivo.
Рис.6. Фотоиндуцированная ишемии у мышей и анализ возникающих при ней дисфункций.
Нами было показано защитное действие при фотоиндуцированной ишемии неканонического пептида-агониста ПАР1 – АП9 in vivo (Рис. 7.).
Рис. 7. ПАР1-опосредованное протекторное действие АП9 при ишемии в модели фототромбоза у мышей.
Известно, что ишемическое повреждение мозга может усугубляться рядом хронических заболеваний, например, диабетом.
Мы исследуем влияние стрептозотоцин-вызванного сахарного диабета у мышей на развитие ишемических повреждений при фототромбозе. Установлено, что диабет усугубляет вызванное ишемией повреждения, вызывая увеличение очага повреждения мозга у мышей в 1,7 раза (Рис. 8).
Рис.8. Сахарный диабет увеличивает объема очага ишемии, вызванный фототромбозом у мышей.
Воспаление является сложной ответной реакцией организм на повреждение или действие патогенов. Данный процесс может также сопутствовать целому ряду нейродегенеративных заболеваний, системных и хронических нарушений обмена и т.д.. Основными участниками воспалительной реакции являются в первую очередь иммунокомпетентные клетки (тучные клетки, макрофаги и др.), исследование механизмов регуляции активности которых, позволяет определить пути коррекции воспаления.
Такого типа исследования проводятся в нашей лаборатории. Мы изучаем роль ПАР и их агонистов в регуляции провоспалительной активации клеток при разных типах патологий. С этой целью мы осуществляем модулирование системного воспаления с помощью введения эндотоксина животным, модуляции бронхиальной астмы (Рис. 9.) и перитонита, а так же исследуем регуляцию активности тучных клеток и макрофагов в модели стрептозотоцин-вызванного диабета у крыс.
Рис. 9. Возможный механизм ПАР-зависимой регуляции воспалительного ответа на фоне бронхиальной астмы у мышей.
В настоящее время неизвестно, каким образом сахарный диабет может влиять на опосредованную ПАР1 активацию тучных клеток и макрофагов. Нами установлено, что тромбин обладает стойким активирующим действием, потенцируя пролиферацию и продукцию NO перитонеальными макрофагами в условиях воспаления, диабета и высокой концентрации глюкозы в среде (Рис. 10.).
Рис. 10. Влияние диабета, тромбина, высокой глюкозы и липополисахарида на перитонеальные макрофаги крысы.
Корешковый (компрессионный) синдром — один из самых распространенных неврологических синдромов, объединяющий целый «букет» симптомов, причиной которых является сдавливание нервных корешков спинного мозга. Боль и изменение чувствительности иннервируемых органов-«мишеней» являются главными компонентами симптомо-комплекса корешкового синдрома (Рис. 11). Исследование компрессионного синдрома (радикулопатии) на животных моделях вносят неоценимых вклад в предоставление о фундаментальных аспектах данной патологии. А анатомически сходное расположение срединного нерва крысы и человека делает его удобной мишенью для изучения шейной радикулопатии, как частного случая нейропатической боли.
Анализ состояния срединного нерва у крыс в посткомпрессионный период исследуется в нашей лаборатории на модели кратковременного пережатия заднего спинно-мозгового корешка (СМК) этого нерва (Рис. 12).
Рис. 11. Последствия компрессии нерва.
Рис.12. Моделирование компрессионного синдрома у крыс.
Мы осуществляем тестирование состояния нерва, как на основе оценки болевой чувствительности, так и электрофизиологически, регистрируя Н-рефлекс и М-ответ мышц соответствующей передней конечности у крыс (Рис. 13).
Рис. 13. Регистрация рефлексов мышц поврежденной конечности крыс.
Используемое нами 15-ти минутное пережатие СМК сопровождалось на 2 сутки после повреждения повышением уровня TNFα лишь в области С7, что свидетельствует о развитии нейровоспаления, что, вероятно, и определяет наблюдаемое нами изменение болевой чувствительности.
Таким образом, выбранная нами модель является актуальной для анализа механизмов развития компрессионного синдрома в области С7 спинного мозга и может быть использована для поиска новых путей диагностики и коррекции повреждения СМК на уровне С7.
Created with Mobirise bootstrap templates